Primer3 gần đây đã được nâng cấp về giao diện và bổ sung thêm một số tính năng mới. Thông tin chi tiết về chương trình này được trình bày trong bài báo được công bố trên Nucleic Acids Research (impact factor: 8.026) năm 2012 với tiêu đề Primer3-new capabilities and interfaces bởi nhóm tác giả tại Đại học Heidelberg (Germany) và Duke-NUS Graduate Medical School (Singapore). Bài báo được cung cấp dưới dạng Open Access, các bạn có thể download miễn phí tại đây: http://nar.oxfordjournals.org/content/40/15/e115.long
Do Primer3 là chương trình mã nguồn mở nên nó có thể được chỉnh sửa về giao diện hoặc tích hợp vào nhiều phần mềm khác nhau. Trong phần 2 của chủ đề này tôi sẽ giới thiệu với các bạn giao diện mới của chương trình Primer3plus với những thông số mặc định phần nào đã tối ưu cho thiết kế primer.
Giao diện của Primer3:
Giao diện nền web: Primer3 (version 0.4.0) tại địa chỉ: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Giao diện nền web: Primer3web (version 4.0.0) tại địa chỉ: http://primer3.wi.mit.edu/
Giao diện trực quan Primer3Plus thiết kế theo Tab dễ sử dụng (Hình 1)
tại địa chỉ: http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
A. Đối với PCR thông thường
1. Bạn để mục Load server settings ở chế độ mặc định (default) và ở thẻ (Tab) Main, hãy dán (paste) trình tự DNA của bạn vào khung trống (Hình 2).
2. Điều chỉnh các thông số ở thẻ General Settings (Hình 3):
- Product size ranges: >= 250 bp để dễ quan sát trên gel agarose, bạn có thể tùy chỉnh theo nhu cầu của mình.
- Primer size: 18-22 bp
- Primer Tm: 57-63°C, với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi (Max Tm Difference) là 3°C
- Primer GC%: 40-60
Hình 3. Khai báo thẻ General Settings
3. Điều chỉnh các thông số ở thẻ Advanced Settings (Hình 4):
- Max Poly-X: 4
(trình tự mồi không nên có quá 4 nucleotides liên tiếp giống hệt nhau)
- Max #N's: 0
(các nucleotide bị lỗi do giải trình tự ở dạng N phải được loại bỏ)
- Number To Return: 1
(Số cặp mồi bạn muốn nhận được, tất nhiên bạn có thể thay số lượng)
Các thông số còn lại bạn có thể để ở chế độ mặc định.
Hình 4. Khai báo thẻ Advanced Settings
4. Pick primers (Hình 4) để nhận cặp mồi mong muốn (Hình 5)
Bạn có thể copy trực tiếp các trình tự primers (mũi tên) và xem kích thước của sản phẩm PCR (khung màu xanh).
B. Đối với real-time PCR (qPCR)
1. Ở mục Load server settings (Hình 2) bạn chọn chế độ qPCR, rồi kích chọn nút Activate Settings (ngay phía dưới). Chế độ thiết kế mồi cho real-time PCR đã được thiết lập một cách cơ bản.
2. Trong thẻ General Settings bạn nên điều chỉnh một chút:
- Product size ranges: 120-180 bp (thông thường), bạn có thể tùy chỉnh từ 80-250 bp.
- Primer size: 20-24 bp
- Primer Tm: 60-64°C, với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi (Max Tm Difference) là 1°C
- Primer GC%: 40-60
3. Ở thẻ Advanced Settings (Hình 4):
- Max Self Complementarity: 3 hoặc 4
- Các thông số còn lại giống với PCR thông thường.
Do Primer3 là chương trình mã nguồn mở nên nó có thể được chỉnh sửa về giao diện hoặc tích hợp vào nhiều phần mềm khác nhau. Trong phần 2 của chủ đề này tôi sẽ giới thiệu với các bạn giao diện mới của chương trình Primer3plus với những thông số mặc định phần nào đã tối ưu cho thiết kế primer.
Giao diện của Primer3:
Giao diện nền web: Primer3 (version 0.4.0) tại địa chỉ: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Giao diện nền web: Primer3web (version 4.0.0) tại địa chỉ: http://primer3.wi.mit.edu/
Giao diện trực quan Primer3Plus thiết kế theo Tab dễ sử dụng (Hình 1)
tại địa chỉ: http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
Hình 1. Giao diện chính của chương trình Primer3plus
A. Đối với PCR thông thường
1. Bạn để mục Load server settings ở chế độ mặc định (default) và ở thẻ (Tab) Main, hãy dán (paste) trình tự DNA của bạn vào khung trống (Hình 2).
Hình 2. Khai báo thẻ Main
- Product size ranges: >= 250 bp để dễ quan sát trên gel agarose, bạn có thể tùy chỉnh theo nhu cầu của mình.
- Primer size: 18-22 bp
- Primer Tm: 57-63°C, với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi (Max Tm Difference) là 3°C
- Primer GC%: 40-60
Hình 3. Khai báo thẻ General Settings
3. Điều chỉnh các thông số ở thẻ Advanced Settings (Hình 4):
- Max Poly-X: 4
(trình tự mồi không nên có quá 4 nucleotides liên tiếp giống hệt nhau)
- Max #N's: 0
(các nucleotide bị lỗi do giải trình tự ở dạng N phải được loại bỏ)
- Number To Return: 1
(Số cặp mồi bạn muốn nhận được, tất nhiên bạn có thể thay số lượng)
Các thông số còn lại bạn có thể để ở chế độ mặc định.
Hình 4. Khai báo thẻ Advanced Settings
4. Pick primers (Hình 4) để nhận cặp mồi mong muốn (Hình 5)
Bạn có thể copy trực tiếp các trình tự primers (mũi tên) và xem kích thước của sản phẩm PCR (khung màu xanh).
Hình 5. Cặp mồi nhận được từ chương trình.
B. Đối với real-time PCR (qPCR)
1. Ở mục Load server settings (Hình 2) bạn chọn chế độ qPCR, rồi kích chọn nút Activate Settings (ngay phía dưới). Chế độ thiết kế mồi cho real-time PCR đã được thiết lập một cách cơ bản.
2. Trong thẻ General Settings bạn nên điều chỉnh một chút:
- Product size ranges: 120-180 bp (thông thường), bạn có thể tùy chỉnh từ 80-250 bp.
- Primer size: 20-24 bp
- Primer Tm: 60-64°C, với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi (Max Tm Difference) là 1°C
- Primer GC%: 40-60
3. Ở thẻ Advanced Settings (Hình 4):
- Max Self Complementarity: 3 hoặc 4
- Các thông số còn lại giống với PCR thông thường.
C. Kiểm tra cặp mồi sẵn có
Bạn có thể dán (paste) trực tiếp cặp mồi cần kiểm tra cho một trình tự ADN nhất định vào mục Left primer and Right primer ở đáy cửa sổ của giao diện chính của chương trình (Hình 1). Sau đó chọn Pick Primers.
Đôi khi bạn phải thiết kế cặp mồi để khuếch đại toàn bộ trình tự mã hóa của một gen (Open Reading Frame - ORF), nghĩa là trình tự cặp mồi của bạn phải cố định ở hai đầu của ORF. Trong nhiều trường hợp Primer3 sẽ báo cho bạn là cặp mồi này không tốt do self-complementary, 3' stability, too high temperature, ... Với tình huống này bạn không cần lo lắng, cứ tiến hành chạy PCR (có thể cần thêm chút DMSO). Nếu trên Gel điện di có nhiều hơn một band mong muốn, hãy xác định sản phẩm PCR của bạn dựa vào kích thước. Bạn cũng có thể kiểm tra hiệu quả khuếch đại của cặp mồi với máy Gradient PCR (sử dụng một dải các nhiệt độ khác nhau).
Đôi khi bạn phải thiết kế cặp mồi để khuếch đại toàn bộ trình tự mã hóa của một gen (Open Reading Frame - ORF), nghĩa là trình tự cặp mồi của bạn phải cố định ở hai đầu của ORF. Trong nhiều trường hợp Primer3 sẽ báo cho bạn là cặp mồi này không tốt do self-complementary, 3' stability, too high temperature, ... Với tình huống này bạn không cần lo lắng, cứ tiến hành chạy PCR (có thể cần thêm chút DMSO). Nếu trên Gel điện di có nhiều hơn một band mong muốn, hãy xác định sản phẩm PCR của bạn dựa vào kích thước. Bạn cũng có thể kiểm tra hiệu quả khuếch đại của cặp mồi với máy Gradient PCR (sử dụng một dải các nhiệt độ khác nhau).
Chúc các bạn thành công.
UniS Biotech Vietnam
Nhận xét
Đăng nhận xét